Rozdiel medzi klonovaním génov a PCR

Kľúčový rozdiel - klonovanie génov vs PCR
 

Syntéza mnohých kópií DNA zo špecifického fragmentu DNA sa nazýva amplifikácia DNA. Existujú dva hlavné procesy amplifikácie DNA, a to klonovanie génov a PCR. Kľúčový rozdiel medzi klonovaním génov a PCR je, Klonovanie génov vedie k vzniku viacerých kópií špecifického génu in vivo vytvorením rekombinantnej DNA a rastom vnútri hostiteľskej baktérie, zatiaľ čo PCR produkuje milióny kópií špecifického fragmentu DNA in vitro podstupujú opakované cykly denaturácie a syntézy.

OBSAH
1. Prehľad a kľúčový rozdiel
2. Čo je klonovanie génov
3. Čo je to PCR
4. Porovnanie bok po boku - klonovanie génov vs PCR
5. Zhrnutie

Čo je klonovanie génov?

Génové klonovanie je technika používaná na lokalizáciu a množenie špecifického génu z extrahovanej genómovej DNA organizmu prostredníctvom konštrukcie rekombinantnej DNA. Genomická DNA obsahuje tisíce rôznych génov kódovaných pre proteíny. Keď sa extrahuje DNA, obsahuje všetky možné gény, ktoré môže niesť. Technika klonovania génov umožnila detekciu špecifického génu z celkovej DNA. Preto je klonovanie génov dôležitým nástrojom molekulárnej biológie.

Vytvorenie genomickej knižnice organizmu je nevyhnutné pri klonovaní génov, ak neexistujú informácie o umiestnení príslušného génu v DNA. Genomická knižnica sa pripravuje pomocou nasledujúcich krokov.

Krok 1: Extrakcia celkovej DNA z organizmu, ktorý obsahuje požadovaný gén.

Krok 2: Restrikčné štiepenie extrahovanej DNA za vzniku malých zvládnuteľných fragmentov. Tento krok je uľahčený reštrikčnými endonukleázami.

Krok 3: Výber vhodného vektora a otvorenie vektorovej DNA pomocou rovnakých reštrikčných endonukleáz. Bakteriálne plazmidy sa bežne používajú ako vektory na prenášanie cudzej DNA. Plazmidy sú malé kruhy DNA nachádzajúce sa v baktériách.

Krok 4: Kombinácia vektorovej DNA a fragmentovanej DNA za vzniku molekuly rekombinantnej DNA. Tento krok sa riadi DNA ligázou.

Krok 5: Prenos rekombinantných molekúl DNA do hostiteľských baktérií. Tento krok sa nazýva transformácia a vykonáva sa pomocou tepelného šoku.

Krok 5: Skríning transformovaných bakteriálnych buniek na kultivačnom médiu. Na konci transformačného procesu sa získa zmiešaná populácia transformovaných a netransformovaných hostiteľských buniek. Gén, ktorý je predmetom záujmu, zahŕňa iba transformované hostiteľské bunky. Preto je potrebné vybrať transformované bunky. Výber sa uskutočňuje pomocou selektívnych médií, ktoré obsahujú antibiotiká. Na tomto skríningovom médiu rastú iba transformované bunky, čo umožňuje selekciu.

Krok 6: Pestovanie baktérií na výrobu génovej knižnice. V tomto kroku sa transformované hostiteľské bunky zavedú do čerstvého kultivačného média, ktoré poskytuje optimálne požiadavky na rast. Celkový počet kolónií na kultivačných platniach predstavuje genomickú knižnicu tohto organizmu.

Krok 7: Rekombinantná molekula DNA obsahujúca požadovaný gén sa musí testovať z tisícov klonovaných fragmentov rekombinantnej DNA. Môže sa to dosiahnuť použitím sond, ktoré označujú špecifický gén alebo špecifický proteín, ktorý je výsledkom tohto génu.

Akonáhle je gén obsahujúci bakteriálnu kolóniu identifikovaný z celkových kolónií, je možné vytvoriť milióny kópií rekombinantného plazmidu, ktorý obsahuje gén..

Génové klonovanie sa používa pri zriaďovaní génových knižníc, pri výrobe špeciálnych bielkovín, vitamínov, antibiotík, hormónov, sekvenovaní a mapovaní genómov organizmov, pri vytváraní mnohonásobných kópií DNA jednotlivcov vo forenznom procese atď..

Obrázok_1: Klonovanie génov

Čo je to PCR?

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je technika, ktorá generuje veľké množstvo kópií konkrétneho fragmentu DNA. Exponenciálna amplifikácia špecifickej sekvencie DNA sa získa pomocou PCR pod in vitro podmienky. Táto technika je veľmi účinným nástrojom v molekulárnej biológii, pretože môže znásobiť malú vzorku DNA do použiteľného množstva. PCR bola zavedená Kary Mullisom v roku 1983 a tento ocenený vynález vytvoril obrovský pokrok v molekulárnej biológii.

Technika PCR nasleduje opakované reakcie PCR, ako je znázornené na obrázku 02. Jedna reakcia PCR pozostáva z troch hlavných krokov, ktoré sa vyskytujú pri troch rôznych teplotách; denaturácia dvojreťazcovej DNA pri 94 ° C ⁰C, žíhanie primerov pri 68 ° C ⁰C a predĺženie vlákna pri 72 ⁰C. Preto, keď sa vykonáva PCR, mala by sa vysoká fluktuácia udržiavať, aby sa správne replikovala. PCR sa uskutočňuje v PCR stroji vo vnútri skúmaviek PCR. PCR skúmavky sa naplnia správnymi zmesami PCR obsahujúcimi templátovú DNA, Taq polymerázu, priméry, dNTP a pufor. Denaturácia dvojvláknovej vzorky DNA na jednovláknovú DNA sa vykonáva prerušením vodíkových väzieb medzi komplementárnymi bázami pri 94 - 98 ⁰C. Potom sa jednovláknové templátovej DNA exponujú na priméry. Malo by sa poskytnúť pár primerov (vpred a vzad) a mali by byť termostabilné, aby tolerovali vysoké teploty. Priméry sú jednovláknové krátke DNA sekvencie komplementárne ku koncom cieľového DNA fragmentu. Pri PCR sa používajú syntetické priméry. Priméry sa viažu s komplementárnymi bázami vzorky DNA a iniciujú syntézu nového vlákna. Tento krok je katalyzovaný enzýmom nazývaným Taq polymeráza; termostabilný enzým DNA polymeráza izolovaný z Thermus auqaticus. Keď sú k dispozícii priméry a nukleotidy (stavebné bloky), Taq polymeráza vytvára nové vlákno DNA komplementárne k templátovej DNA. Na konci programu PCR sa pomocou gélovej elektroforézy pozoruje amplifikovaný fragment DNA. Ak sa vyžaduje ďalšia analýza, produkt PCR sa z gélu vyčistí.

PCR je veľmi užitočná na diagnostiku a monitorovanie genetických a získaných chorôb, identifikáciu zločincov (v oblasti forenznej analýzy), štúdium štruktúry a funkcie cieľového segmentu DNA, sekvenovanie a mapovanie genómov organizmov, atď. PCR sa stala rutinná laboratórna technika vo výskumných laboratóriách lekárskej a molekulárnej biológie medzi vedcami, pretože má širokú škálu aplikácií.

Obrázok_2: Polymerázová reťazová reakcia

Aký je rozdiel medzi klonovaním génov a PCR?

Klonovanie génov vs PCR
Klonovanie génov je proces vytvárania viacerých kópií špecifického génu in vivo prostredníctvom rekombinantnej DNA a transformácie na hostiteľskú baktériu.	Technika PCR produkuje viacnásobné kópie konkrétnej sekvencie DNA in vitro opakovanými cyklami PCR reakcií.
Požiadavka na konštrukciu rekombinantnej DNA
Produkuje sa rekombinantná DNA, aby sa lokalizoval gén.	Rekombinantná DNA sa nevytvára.
Potreba práce
Tento proces je náročný na pracovnú silu.	Intenzívna práca nie je potrebná.
Proces in vivo alebo in vitro
Konštrukcia rekombinantnej DNA je in vitro a amplifikácia DNA je in vivo.	K amplifikácii DNA dochádza úplne in vitro.

Zhrnutie - Klonovanie génov vs PCR

Génové klonovanie a PCR sú dve metódy používané na amplifikáciu DNA. PCR je in vitro proces, ktorý vytvára viacnásobné kópie DNA konkrétneho fragmentu DNA bez použitia rekombinantnej DNA a hostiteľského organizmu. Klonovanie génov je primárne in vivo proces, ktorý vedie k viacnásobným kópiám génu, ktorý má záujem, v hostiteľskom organizme prostredníctvom konštrukcie rekombinantnej DNA. Toto je rozdiel medzi génovým klonovaním a PCR.

referencie:
1. Griffiths, Anthony JF. „Klonovanie špecifického génu.“ Moderná genetická analýza. U.S. National Library of Medicine, 1. januára 1999. Web. 22. februára 2017
2. „Polymerázová reťazová reakcia (PCR).“ Národné centrum pre biotechnologické informácie. U.S. National Library of Medicine, n.d. Web. 22. februára 2017

S láskavým dovolením:
1. „Obrázok 17 01 06“ od CNX OpenStax - (CC BY 4.0) prostredníctvom Commons Wikimedia
2. „PCR“ od Madprime - vlastná práca (CC BY-SA 3.0) prostredníctvom Commons Wikimedia