Rozdiel medzi NGS a Sangerovým sekvencovaním

Kľúčový rozdiel - sekvencia NGS verzus Sanger
 

Sekvenovanie nasledujúcej generácie (NGS) a Sangerove sekvenovanie sú dva typy techník sekvenovania nukleotidov vyvinutých v priebehu času. Metóda Sanger Sequencing sa už veľa rokov používala a NGS ju nedávno nahradila kvôli jej výhodám. Kľúčovým rozdielom medzi NGS a Sangerovým sekvencovaním je to NGS pracuje na princípe postupného sekvenovania miliónov sekvencií rýchlym spôsobom prostredníctvom systému sekvencovania, zatiaľ čo sekvencia Sangerových sekvencií funguje na princípe ukončenia reťazca v dôsledku selektívnej inkorporácie dideoxynukleotidov enzýmom DNA polymerázy počas replikácie DNA a výsledného oddelenia fragmentov kapilárou. elektroforéza.

OBSAH
1. Prehľad a kľúčový rozdiel
2. Čo je nukleotidové sekvenovanie
3. Čo je NGS
4. Čo je sekvencia Sangerov
5. Porovnanie bok po boku - sekvenovanie NGS verzus Sanger
6. Zhrnutie

Čo je nukleotidové sekvenovanie?

Genetická informácia je uložená v nukleotidových sekvenciách DNA alebo RNA organizmu. Proces stanovenia správneho poradia nukleotidov (pomocou štyroch báz) v danom fragmente (v géne, zhluku génov, chromozóme a kompletnom genóme) je známy ako sekvencia nukleotidov.. V genómových štúdiách, forenzných štúdiách, virologii, biologickej systematike, lekárskej diagnostike, biotechnológii av mnohých ďalších oblastiach je veľmi dôležité analyzovať štruktúru a funkciu génov. Vedci vyvinuli rôzne typy sekvenčných metód. Medzi nimi, Sangerove sekvenovanie vyvinutý Frederickom Sangerom v roku 1977, bol široko používaný a popularizovaný po dlhú dobu až do roku 2007 Sekvenovanie nasledujúcej generácie nahradil ho.

Čo je NGS?

Sekvencia novej generácie (NGS) je termín používaný na označenie moderných vysoko výkonných sekvenčných procesov. Opisuje celý rad rôznych moderných sekvenčných technológií, ktoré prevratili genomické štúdie a molekulárnu biológiu. Týmito technikami sú sekvenovanie Illumina, sekvenovanie Roche 454, sekvenovanie iónových protónov a sekvenovanie SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). Systémy NGS sú rýchlejšie a lacnejšie. V NGS systémoch sa používajú štyri hlavné metódy sekvencovania DNA; pyrosekvenovanie, sekvenovanie syntézou, sekvenovanie ligáciou a iónové polovodičové sekvenovanie. Paralelne je možné sekvenovať veľké množstvo reťazcov DNA alebo RNA (milióny). Umožňuje sekvenovanie celého genómu organizmov v krátkom časovom období, na rozdiel od sekvenovania Sanger, ktoré zaberie viac času.

NGS má oproti konvenčnej Sangerovej metóde mnoho výhod. Je to vysokorýchlostný, presnejší a nákladovo efektívny postup, ktorý sa dá vykonať s malou veľkosťou vzorky. NGS sa môže použiť v metagenomických štúdiách, pri detekcii variácií v rámci jedného genómu v dôsledku inzercií a delécií atď. A pri analýze génových expresií..

Obrázok_1: Vývoj v sekvenovaní NGS

Čo je sekvencia Sanger?

Sekvencovanie Sanger je sekvenčná metóda vyvinutá Frederickom Sangerom a jeho kolegami v roku 1977 na stanovenie presného poradia nukleotidov daného fragmentu DNA. Je tiež známy ako sekvenčné ukončenie reťazca alebo Dideoxy sekvenovanie. Pracovným princípom tohto spôsobu je ukončenie syntézy vlákien selektívnou inkorporáciou dideoxynukleotidov zakončujúcich reťazec (ddNTP), ako je ddGTP, ddCTP, ddATP a ddTTP, DNA polymerázou počas replikácie DNA. Normálne nukleotidy majú 3 'OH skupiny na vytvorenie fosfodiesterovej väzby medzi susednými nukleotidmi, aby sa pokračovalo vo formovaní vlákna. Avšak ddNTPs nemajú túto 3 'OH skupinu a nie sú schopné tvoriť fosfodiesterové väzby medzi nukleotidmi. Preto je predĺženie reťazca zastavené.

V tomto spôsobe slúži jednovláknová DNA, ktorá sa má sekvenovať, ako templátové vlákno in vitro DNA syntéza. Ďalšími požiadavkami sú oligonukleotidový primér, deoxynukleotidové prekurzory a enzým DNA polymeráza. Ak sú známe hraničné konce cieľového fragmentu, môžu byť priméry ľahko navrhnuté pre replikáciu DNA. V štyroch samostatných skúmavkách sa uskutočňujú štyri samostatné reakcie syntézy DNA. Každá trubica má samostatné ddNTP spolu s ďalšími požiadavkami. Z konkrétneho nukleotidu sa pridá zmes dNTP a ddNTP. Podobne sa uskutočnia štyri oddelené reakcie v štyroch skúmavkách so štyrmi zmesami. Po reakciách sa uskutoční detekcia fragmentov DNA a konverzia vzoru fragmentov na sekvenčné informácie. Výsledné fragmenty DNA sa tepelne denaturujú a separujú gélovou elektroforézou. Ak sa použijú rádioaktívne nukleotidy, prúžkovaný obrazec v polyakrylamidovom géli sa dá vizualizovať autorádiografiou. Ak táto metóda využíva fluorescenčne značené dideoxynukleotidy, môže sa zmierniť dolu odčítaním gélu a prejsť lúčom lasera, ktorý sa má detekovať fluorescenčným detektorom. Aby sa predišlo chybám, ktoré môžu vzniknúť, keď sa sekvencia prečíta okom a vstúpi ručne do počítača, táto metóda sa vyvinula do použitia automatizovaného sekvencera spojeného s počítačom..

Toto je metóda použitá na sekvenovanie DNA z projektu Human Genome. Táto metóda sa stále používa s pokročilými úpravami, pretože poskytuje presné informácie o sekvencii napriek tomu, že je to nákladný a pomalý proces.

Obrázok_2: Sekvenovanie Sangerov

Aký je rozdiel medzi NGS a Sangerovým sekvenovaním?

Sekvenovanie NGS verzus Sanger
Sekvencie novej generácie (NGS) sa týkajú moderných vysoko výkonných sekvenčných procesov. Opisuje množstvo rôznych moderných technológií sekvenovania	Sekvencia Sangerov je sekvenčná metóda vyvinutá Frederickom Sangerom na určenie presného poradia nukleotidov daného fragmentu DNA.
Efektivita nákladov
NGS je lacnejší proces, pretože znižuje čas, ľudskú silu a chemikálie.	Je to nákladný proces, pretože to vyžaduje čas, ľudskú silu a viac chemikálií.
rýchlosť
Je to rýchlejšie, pretože sa súčasne deje chemická detekcia aj detekcia signálu mnohých vlákien.	Toto je časovo náročné, pretože chemická detekcia a detekcia signálu sa odohrávajú ako dva samostatné procesy a môžu sa čítať naraz iba na vlákne.
Spoľahlivosť
NGS je spoľahlivý.	Sangerove sekvenovanie je menej spoľahlivé
Veľkosť vzorky
NGS vyžaduje menšie množstvo DNA.	Táto metóda vyžaduje veľké množstvo templátovej DNA.
DNA bázy na sekvenovaný fragment
Počet DNA báz na sekvenovaný fragment je nižší ako Sangerova metóda	Generujúce sekvencie sú dlhšie ako NGS sekvencie.

Zhrnutie - NGS vs Sanger Sequencing

Sekvencie NGS a Sanger sú techniky nukleotidového sekvenovania, ktoré sa v Molecular Biology značne používajú. Sangerove sekvenovanie je metóda skorého sekvenovania, ktorá bola nahradená NGS. Hlavný rozdiel medzi NGS a Sangerovým sekvencovaním je, že NGS je vysokorýchlostný, presnejší a nákladovo efektívnejší proces ako Sangerovo sekvenovanie. Obe techniky spôsobili závažné ohniská genetiky a biotechnológie.

referencie:
1. Nowrousian, Minou. „Techniky sekvenovania novej generácie pre eukaryotické mikroorganizmy: riešenia biologických problémov založené na sekvenovaní.“ Eukaryotická bunka. Americká spoločnosť pre mikrobiológiu, september 2010. Web. 18. februára 2017
2. Sanger, F., S. Nicklen, a A. R. Coulson. „Sekvenovanie DNA s inhibítormi ukončujúcimi reťazec.“ Zborník Národnej akadémie vied 74.12 (1977): 5463-467. web.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu a Maggie Law. „Porovnanie sekvenčných systémov budúcej generácie.“ Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012 (2012): 1-11. web.

S láskavým dovolením:
“Sanger-sequining” Autor: Estevezj - Vlastná práca (CC BY-SA 3.0) prostredníctvom Commons Wikimedia 
„Vývoj v sekvenovaní ďalšej generácie“ Autor: Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) prostredníctvom Commons Wikimedia