Rozdiel medzi severným južným a západným blotovaním

Kľúčový rozdiel - severná vs južná verzus západná blotting
 

Detekcia špecifických sekvencií DNA, RNA a proteínov je nevyhnutná pre rôzne typy štúdií v molekulárnej biológii. Gélová elektroforéza je technika, ktorá oddeľuje DNA, RNA a proteíny podľa ich veľkosti. Z profilov gélu sa pomocou špeciálnych techník nazývaných blotting a hybridizácia so značenými sondami deteguje konkrétna sekvencia DNA, RNA sekvencia alebo proteín. Existujú tri rôzne spôsoby prenosu, a to južný, severný a západný. Kľúčový rozdiel medzi severným južným a západným prenosom spočíva v type molekuly, ktorú zo vzorky zistí. Southern blotting je metóda, ktorá detekuje špecifickú sekvenciu DNA zo vzorky DNA. Northern blotting je technika, ktorá detekuje špecifickú sekvenciu RNA zo vzorky RNA. Western blotting je metóda, ktorá detekuje špecifický proteín zo vzorky proteínu.

OBSAH
1. Prehľad a kľúčový rozdiel
2. Čo je Southern Blotting
3. Čo je Northern Blotting
4. Čo je Western Blotting
5. Porovnanie bok po boku - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Zhrnutie

Čo je Southern Blotting?

Technika Southern blotting bola vyvinutá E. M. Southern v roku 1975 na identifikáciu špecifickej sekvencie DNA zo vzorky DNA. Toto je prvá technika prenosu údajov zavedená v molekulárnej biológii. Umožnil detekciu špecifických génov z DNA, špecifických fragmentov z DNA atď. V technike Southern blotting je zahrnutých niekoľko krokov. Sú nasledujúce.

1. DNA je izolovaná zo vzorky a štiepená reštrikčnými endonukleázami.
2. Štiepená vzorka sa separuje elektroforézou na agarózovom géli.
3. Fragmenty DNA v géli sú denaturované na jednotlivé vlákna pomocou alkalického roztoku.
4. Jednovláknová DNA sa prenesie na nitrocelulózovú filtračnú membránu kapilárnym prenosom.
5. Prenesená DNA je fixovaná trvalo na membráne.
6. Fixovaná DNA na membráne sa hybridizuje so značenými sondami.
7. Nenaviazaná DNA sa premyje z membrány premytím.
8. Röntgenový film sa exponuje membráne a pripraví sa autorádiograf.

Southern blotting sa používa pre rôzne aspekty molekulárnej biológie. Je užitočný pri mapovaní RFLP, forenzných štúdiách, metylácii DNA pri génovej expresii, detekcii mutovaných génov pri genetických poruchách, snímaní DNA, atď..

Obrázok 01: Technika Southern Blotting

Čo je Northern Blotting?

Northern blotting je metóda určená na detekciu špecifickej RNA sekvencie alebo mRNA sekvencie zo vzorky na štúdium génovej expresie. Táto technika bola vyvinutá Alwine, Kempom a Starkom v roku 1979. Líši sa od techník na severnom a západnom pobreží v dôsledku niekoľkých krokov. Táto technika sa však tiež uskutočňuje gélovou elektroforézou, blotovaním a hybridizáciou so špecifickými značenými sondami a detekciou. Technika Northern blotting sa uskutočňuje nasledujúcim spôsobom.

1. RNA sa extrahuje zo vzorky a separuje sa gélovou elektroforézou.
2. RNA sa prenesie z gélu na pijavú membránu a fixuje sa.
3. Membrána je ošetrená značenou sondou pripravenou z cDNA alebo RNA (sonda je komplementárna so špecifickou sekvenciou vo vzorke)..
4. Sonda sa inkubuje s membránou, aby sa viazala so špecifickou sekvenciou.
5. Nenaviazané sondy sa vymyjú.
6. Hybridizované fragmenty sa detegujú autorádiografom.

Northern blotting je dôležitým nástrojom na detekciu a kvantifikáciu hybridizovanej mRNA, štúdium degradácie RNA, hodnotenie polčasu rozpadu RNA, detekciu zostrihu RNA, štúdium génovej expresie atď..

Obrázok 02: Northern Blotting

Čo je Western Blotting?

Western blotting je metóda detekcie špecifického proteínu zo zmesi proteínov pomocou značenej protilátky. Preto je western blot známy aj ako imunoblot. Túto techniku ​​zaviedol Towbin a kol v roku 1979 a teraz sa bežne vykonáva v laboratóriách na analýzu proteínov. Kroky sú nasledujúce.

1. Proteíny sa extrahujú zo vzorky
2. Proteíny sa separujú podľa ich veľkosti pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli
3. Separované molekuly sa elektroporáciou prenášajú na PVDF membránu alebo nitrocelulózovú membránu
4. Membrána je blokovaná pre nešpecifickú väzbu s protilátkami
5. Prenesené proteíny sú naviazané na primárnu protilátku (enzýmom značené protilátky).
6. Membrána sa premyje, aby sa odstránili nešpecificky viazané primárne protilátky
7. Naviazané protilátky sa detegujú pridaním substrátu a detekciou vytvorenej farebnej zrazeniny

Western blotting je užitočný pri detekcii anti-HIV protilátok vo vzorke ľudského séra. Western blot sa môže tiež použiť ako potvrdzujúci test na infekciu hepatitídy B a definitívny test na ochorenie šialených kráv..

Obrázok 03: Western blotting

Aký je rozdiel medzi severným južným a západným prenosom?

Northern vs Southern vs Western Blotting
Typ detekovanej molekuly
Northern Blotting	Northern blotting detekuje špecifickú sekvenciu RNA zo vzorky RNA.
Southern Blotting	Southern blotting detekuje špecifickú sekvenciu DNA zo vzorky DNA.
Western Blotting	Western blot detekuje špecifický proteín zo vzorky proteínu.
Typ gélu
Northern Blotting	Používa sa gél agarózy / formaldehydu.
Southern Blotting	Používa sa gél Agarose.
Western Blotting	Používa sa polyakrylamidový gél.
Metóda blokovania
Northern Blotting	Toto je kapilárny transfer.
Southern Blotting	Toto je kapilárny transfer.
Western Blotting	Toto je elektrický prenos.
Použité sondy
Northern Blotting	cDNA alebo RNA sondy značené rádioaktívne alebo nerádioaktívne.
Southern Blotting	DNA sondy sú značené rádioaktívne alebo nerádioaktívne.
Western Blotting	Ako sondy sa používajú primárne protilátky.
Detekčný systém
Northern Blotting	Toto sa vykonáva pomocou autorádiografu alebo detekciou zmeny svetla alebo farby.
Southern Blotting	To sa vykonáva pomocou autorádiografu, detekcie zmeny svetla alebo farby.
Western Blotting	To sa deje pomocou detekcie zmeny svetla alebo farby.

Zhrnutie - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotovanie je špeciálna technika vyvinutá na identifikáciu špecifickej DNA, RNA alebo proteínu zo vzoriek. Existujú tri samostatné blotovacie postupy, konkrétne severná, južná a západná, na detekciu špecifického typu molekuly. Technika Northern blotting je navrhnutá tak, aby detegovala špecifickú sekvenciu RNA zo zmesi RNA. Technika Southern blotting umožňuje detekciu špecifickej sekvencie DNA zo vzorky DNA a vyvinula sa metóda western blot na identifikáciu špecifického proteínu zo zmesi proteínov..

Referencie
1. Gibbons, Janay. „Western Blot: Prehľad prenosu proteínov.“ North American Journal of Medical Sciences. Medknow Publications & Media Pvt Ltd, Mar. 2014. Web. 27 marec 2017
2. Brown, T. „Southern blotting.“ Aktuálne protokoly v imunológii. U.S. National Library of Medicine, máj 2001. Web. 27 marec 2017
3. Šan L. „Northern blot.“ Metódy v enzymológii. US National Library of Medicine, 2013. Web. 27 marec 2017

S láskavým dovolením:
1. „Northern Blot Scheme“ od RNA405 - vlastná práca (public domain) prostredníctvom Commons Wikimedia
2. „Western blot 114A“ Autor: Amanthabagdon - vlastná práca (public domain) prostredníctvom Commons Wikimedia