Rozdiel medzi Sangerovým sekvencovaním a pyrosekvenovaním

Kľúčový rozdiel - sekvenovanie Sangerov vs.
 

Sekvenovanie DNA je veľmi dôležité pre analýzu DNA, pretože znalosť správneho usporiadania nukleotidov v konkrétnej oblasti DNA odhaľuje množstvo dôležitých informácií o ňom. Existujú rôzne metódy sekvenovania DNA. Sangerove sekvenovanie a pyrosekvenovanie sú dve rôzne metódy sekvenovania DNA široko používané v Molecular Biology. Kľúčovým rozdielom medzi Sangerovým sekvencovaním a pyrosekvenovaním je to Sangerove sekvenovanie používa dideoxynukleotidy na ukončenie syntézy DNA na čítanie nukleotidovej sekvencie, zatiaľ čo pyroekvizovanie deteguje uvoľňovanie pyrofosfátu začlenením nukleotidov a syntetizovaním komplementárnej sekvencie na čítanie presného poradia sekvencie.

OBSAH
1. Prehľad a kľúčový rozdiel
2. Čo je sekvencia Sangerov
3. Čo je to pyrosekvenovanie
4. Porovnanie bok po boku - Sangerove sekvenovanie verzus pyroekvenovanie
5. Zhrnutie

Čo je sekvencia Sanger?

Sangerove sekvenovanie je prvá generácia DNA sekvenčnej metódy vyvinutá Frederickom Sangerom a jeho školami v roku 1977. Je tiež známa ako Poradie ukončenia reťazca alebo Dideoxy sekvenovanie pretože je založený na ukončení reťazca pomocou dideoxynukleotidov (ddNTP). Táto metóda sa široko používala viac ako 30 rokov, kým sa nevypracovalo sekvenovanie novej generácie (NGS). Sangerova sekvenčná technika umožnila objavenie správneho nukleotidového poriadku alebo pripojenie konkrétneho fragmentu DNA. Je založená na selektívnom začlenení ddNTP a ukončení syntézy DNA v priebehu in vitro Replikácia DNA. Neprítomnosť 3 'OH skupín na pokračovanie vo vytváraní fosfodiesterovej väzby medzi susednými nukleotidmi je jedinečným znakom ddNTP. Akonáhle je teda pripojený ddNTP, predlžovanie reťazca prestane a končí od tohto bodu. V Sangerovom sekvencovaní sa používajú štyri ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP a ddTTP. Tieto nukleotidy zastavujú proces replikácie DNA, keď sú začlenené do rastúceho reťazca DNA a vedú k rôznym dĺžkam krátkej DNA. Elektroforéza kapilárneho gélu sa používa na usporiadanie týchto krátkych reťazcov DNA podľa ich veľkosti na géli, ako je znázornené na obrázku 01.

Obrázok 1: Kapilárna gélová elektroforéza syntetizovanej krátkej DNA

pre in vitro Pri replikácii DNA by sa malo ustanoviť málo požiadaviek. Sú to enzým DNA polymerázy, templátová DNA, oligonukleotidové priméry a deoxynukleotidy (dNTP). Pri Sangerovom sekvenovaní sa replikácia DNA uskutočňuje v štyroch samostatných skúmavkách spolu so štyrmi typmi ddNTP osobitne. Deoxynukleotidy nie sú úplne nahradené príslušnými ddNTP. Do skúmavky je zahrnutá zmes konkrétneho dNTP (napríklad dATP + ddATP) a replikovaná. Štyri samostatné skúmavky sa nechajú bežať na géli v štyroch samostatných jamkách. Potom odčítaním gélu môže byť sekvencia skonštruovaná tak, ako je to znázornené na obrázku 02.

Obrázok 02: Sangerove sekvenovanie

Sangerove sekvenovanie je dôležitá technika, ktorá pomáha v mnohých oblastiach molekulárnej biológie. Projekt ľudského genómu bol úspešne ukončený pomocou metód založených na Sangerovom sekvencovaní. Sangerove sekvenovanie je tiež užitočné pri sekvenovaní cieľovej DNA, pri výskume rakoviny a genetických chorôb, pri analýze génovej expresie, pri identifikácii človeka, pri detekcii patogénov, pri mikrobiálnom sekvenovaní atď..

Existuje niekoľko nevýhod sekvenovania Sanger:

• Dĺžka sekvenovanej DNA nemôže byť dlhšia ako 1000 párov báz
• Naraz je možné sekvenovať iba jeden reťazec.
• Tento proces je časovo náročný a nákladný.

S cieľom prekonať tieto problémy sa preto s postupom času vyvinuli nové pokročilé techniky sekvenovania. Avšak Sangerove sekvenovanie sa stále používa kvôli svojim veľmi presným výsledkom až do fragmentov s dĺžkou približne 850 párov báz.

Čo je pyroekonvencia?

Pyrosekvenovanie je nová technika sekvenovania DNA založená na „sekvenovaní syntézou“. Táto technika sa spolieha na detekciu uvoľňovania pyrofosfátov po inkorporácii nukleotidov. Tento proces využívajú štyri rôzne enzýmy: DNA polymorfná, ATP sulfuryláza, luciferáza a apyráza a dva substráty adenozín-5 'fosfosulfát (APS) a luciferín.

Proces sa začína väzbou priméru s jednovláknovým templátom DNA a DNA polymeráza začína inkorporáciu nukleotidov s ňou komplementárnych. Keď sa nukleotidy spoja (polymerizácia nukleových kyselín), uvoľňujú pyrofosfátové skupiny (dve fosfátové skupiny spojené dohromady) a energiu. Každý prídavok nukleotidu uvoľňuje ekvimolárne množstvo pyrofosfátu. Pyrofosfát sa prevádza na ATP sulfurázou ATP v prítomnosti substrátu APS. Vytvorený ATP riadi luciferázou sprostredkovanú konverziu luciferínu na oxyluciferín, čím vytvára viditeľné svetlo v množstvách, ktoré sú úmerné množstvu ATP. Svetlo je detekované zariadením na detekciu fotónov alebo fotonásobičom a vytvára pyrogram. Apyráza degraduje ATP a nezačlenené dNTP v reakčnej zmesi. Pridávanie dNTP sa vykonáva naraz. Pretože pridanie nukleotidu je známe podľa inkorporácie a detekcie svetla, je možné určiť sekvenciu templátu. Pyrogram sa používa na generovanie nukleotidovej sekvencie vzorky DNA, ako je znázornené na obrázku 03.

Pyrosekvenovanie je veľmi dôležité pri analýze jedno nukleotidového polymorfizmu a sekvenovaní krátkych úsekov DNA. Vysoká presnosť, flexibilita, jednoduchosť automatizácie a paralelné spracovanie sú výhodou pyroekonvencie oproti technikám sekvenovania Sanger.

Obrázok 03: Pyrosekvenovanie

Aký je rozdiel medzi Sangerovým sekvencovaním a pyrosekvenovaním?

Sekvencovanie Sangerov vs.
Sangerove sekvenovanie je DNA sekvenčná metóda založená na selektívnom začlenení ddNTPs pomocou DNA polymerázy a ukončenia reťazca.	Pyrosekvenovanie je metóda sekvenovania DNA založená na detekcii uvoľňovania pyrofosfátov po inkorporácii nukleotidov.
Použitie ddNTP
ddNTP sa používajú na ukončenie replikácie DNA	ddNTP sa nepoužívajú.
Zúčastnené enzýmy
Používa sa DNA polymeráza.	Používajú sa štyri enzýmy: DNA polymeráza, ATP sulfuryláza, Luciferáza a apyráza.
Použité substráty
APS a Luciferin sa nepoužívajú.	Používajú sa adenozín-5 'fosfosulfát (APS) a luciferín.
Maximálna teplota
Toto je pomalý proces.	Je to rýchly proces.

Zhrnutie - Sangerove sekvenovanie vs pyrosekvenovanie

Sangerove sekvenovanie a pyrosekvenovanie sú dve metódy sekvenovania DNA používané v molekulárnej biológii. Sangerove sekvenovanie vytvára poradie nukleotidov v sekvencii ukončením predlžovania reťazca, zatiaľ čo pyroekonvenovanie vytvára presné poradie nukleotidov v sekvencii inkorporáciou nukleotidov a detekciou uvoľňovania pyrofosfátov. Hlavným rozdielom medzi Sangerovým sekvencovaním a pyroekvenovaním je preto to, že Sangerove sekvenovanie pracuje na sekvencovaní pomocou ukončenia reťazca, zatiaľ čo pyroekonvenčné práce na sekvenovaní pomocou syntézy.

referencie:
1. Fakruddin, Md a Abhijit Chowdhury. „Pyroekvenovanie - alternatíva k tradičnej sekvencii Sangerov.“ American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Science Publications, 2. 3. 2012. Web. 28 február 2017.
2. „Sangerove sekvenovanie“. Sangerove sekvenovanie - témy ScienceDirect. N.p., n.d. Web. 28 február 2017

S láskavým dovolením:
1. „Didesoxy-Methode“ Christoph Goemans (modifikovaný) - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) prostredníctvom Commons Wikimedia
2. „Sanger-DNA-seq“ Enzom v poľskom jazyku Wikipedia (CC BY-SA 3.0) prostredníctvom Commons Wikimedia
3. „Pyrosekvenovanie“ mikrobiologickými bajtmi (CC BY-SA 2.0) prostredníctvom služby Flickr