Rozdiel medzi sekvenovaním PCR a DNA

Kľúčový rozdiel - PCR vs. sekvenovanie DNA
 

PCR a DNA sekvenovanie sú dve dôležité techniky v Molecular Biology. Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je proces, ktorý vytvára veľké množstvo kópií fragmentu DNA. DNA sekvenovanie je technika, ktorá vedie k presnému poradiu nukleotidov daného fragmentu DNA. Toto je kľúčový rozdiel medzi PCR a DNA sekvenovaním. PCR je jedným z hlavných krokov zapojených do sekvenovania DNA.

OBSAH
1. Prehľad a kľúčový rozdiel
2. Čo je to PCR
3. Čo je sekvenovanie DNA
4. Porovnanie bok po boku - PCR verzus DNA Sequencing
5. Zhrnutie

Čo je to PCR?

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je technika amplifikácie DNA používaná v Molecular Biology. Vytvára tisíce až milióny kópií konkrétneho fragmentu DNA. Táto metóda bola vyvinutá Kary Mullisom v roku 1983. V tejto technike fragment DNA, ktorý sa má amplifikovať, slúži ako templát a enzým DNA polymeráza pridáva komplementárne nukleotidy k priméru, ktorý je k dispozícii v zmesi PCR. Na konci reakcie PCR sa syntetizuje veľa kópií vzorky DNA.

Existujú rôzne zložky zmesi PCR, vrátane DNA, DNA polymerázy (Taq polymeráza), primerov (forward a reverzných primerov), nukleotidov (stavebné bloky DNA) a tlmivého roztoku. PCR prebieha vo vnútri stroja PCR a do zariadenia by sa mala naložiť správna zmes PCR a mal by sa riadiť správny program. Táto technika umožňuje produkovať tisíce až milióny kópií konkrétnej časti DNA z veľmi malého množstva DNA.

Reakcie PCR prebiehajú cyklickým spôsobom, aby sa na géli vytvorilo viditeľné množstvo produktov PCR. Do PCR reakcie sú zapojené tri hlavné kroky, a to denaturácia, žíhanie priméru a predĺženie vlákna, ako je znázornené na obrázku 01. Tieto tri kroky sa vyskytujú pri troch rôznych teplotách. DNA existuje v dvojreťazcovej forme vodíkovými väzbami medzi komplementárnymi bázami. Pred implikáciou by sa mala dvojvláknová DNA od seba oddeliť. Uskutočňuje sa tým, že sa dáva vysoká teplota. Pri vysokej teplote sa dvojvláknová DNA denaturuje na jednotlivé vlákna. Potom by sa primery mali priblížiť k okrajovým koncom špecifického fragmentu alebo génu DNA. Primér je krátky kus jednovláknovej DNA, ktorá je komplementárna k cieľovej sekvencii. Predné a reverzné primery sa anelovali s komplementárnymi bázami na lemujúcich koncoch denaturovanej DNA pri teplote nasedania. Základný náter by mal byť odolný voči teplu. Akonáhle priméry nasedajú so vzorkou DNA, enzým taq polymeráza iniciuje syntézu nových vlákien pridaním nukleotidov, ktoré sú komplementárne k cieľovej DNA. Taq polymeráza je tepelne stabilný enzým izolovaný z termofilnej baktérie zvanej Thermus aquaticus. PCR pufor udržuje optimálne podmienky pre pôsobenie taq polymerázy. Tieto tri štádiá PCR reakcií sa opakujú, aby sa získalo požadované množstvo produktu PCR. Po každej reakcii PCR sa počet kópií DNA zdvojnásobí. Preto môže byť pri PCR pozorovaná exponenciálna amplifikácia. Produkty PCR môžu byť pozorované pomocou gélovej elektroforézy a môžu byť pre ďalšie štúdie purifikované.

Obrázok 01: Hlavné kroky PCR reakcie

PCR je cenným nástrojom v lekárskom a biologickom výskume. PCR má osobitnú hodnotu vo forenznej vede, pretože môže amplifikovať DNA pre štúdie z malých vzoriek od zločincov a vytvárať forenzné profily DNA. PCR sa široko používa v mnohých oblastiach molekulárnej biológie vrátane genotypizácie, klonovania génov, detekcie mutácií, sekvenovania DNA, DNA čipov a testovania otcovstva atď..

Obrázok 02: Polymerázová reťazová reakcia

Čo je sekvenovanie DNA?

DNA sekvenovanie je určenie presného poradia nukleotidov - adenínu, guanínu, cytozínu a tymínu v danom fragmente DNA. Genetické informácie sa ukladajú do DNA sekvencií pomocou správneho poradia nukleotidov. Zistenie presného poradia nukleotidov v fragmente DNA je preto veľmi dôležité vedieť o štruktúre a funkcii génov..

Protokol sekvenovania DNA zahŕňa rôzne procesy. Prvým krokom je izolácia zainteresovanej DNA alebo genomickej DNA organizmu. Použitím PCR (ako je opísané vyššie) by sa mala amplifikovať požadovaná oblasť DNA. Amplifikovaný produkt PCR by mal byť separovaný gélovou elektroforézou a purifikovaný. Amplifikované fragmenty slúžia ako templáty na sekvenovanie. Sekvenovanie sa môže uskutočniť buď podľa Sangerovho sekvencovania alebo pomocou vysoko výkonného spôsobu sekvenovania. Sangerove sekvenovanie vyžaduje kapilárnu elektroforézu výsledných fragmentov DNA. Stanovenie správneho poradia nukleotidov sa môže vykonať manuálnym načítaním autorádiografov alebo použitím automatických sekvencerov DNA.

Génové sekvenovanie prispelo k projektu ľudského genómu a uľahčilo mapovanie ľudského genómu v roku 2003. V forenznej analýze umožnilo sekvenovanie DNA identifikáciu jedincov, ktorí vykazujú jedinečné sekvencie DNA a identifikujú zločincov. V medicíne sa sekvenovanie DNA môže použiť na detekciu génov zodpovedných za genetické a iné choroby, nájdenie chybných génov a ich nahradenie správnymi génmi. V poľnohospodárstve sa informácie o sekvenovaní DNA niektorých mikroorganizmov používajú na produkciu transgénnych plodín s ekonomicky požadovanými charakteristikami.

Obrázok 03: Sekvenovanie DNA

Aký je rozdiel medzi sekvenovaním PCR a DNA?

PCR vs DNA Sekvenovanie
Proces PCR vytvára tisíce až milióny kópií fragmentu DNA, ktorý má záujem.	DNA sekvenovanie je proces stanovenia presného poradia nukleotidov v danom fragmente DNA.
výsledok
PCR vytvára tisíce až milióny kópií konkrétneho fragmentu DNA	To vedie k správnemu poradiu báz v konkrétnom fragmente DNA.
Zapojenie ddNTP
PCR nevyžaduje ddNTP. Používa dNTP.	DNA sekvenovanie vyžaduje ddNTP na ukončenie tvorby vlákien.

Zhrnutie - PCR vs DNA Sequencing

PCR a DNA sekvenovanie sú veľmi dôležitými nástrojmi v mnohých oblastiach molekulárnej biológie. Amplifikácia fragmentov DNA sa uskutočňuje technikou PCR, zatiaľ čo správny postup nukleotidov fragmentu DNA sa určuje sekvenovaním DNA. Toto je rozdiel medzi sekvenovaním PCR a DNA.

referencie:
1. „Polymerázová reťazová reakcia (PCR).“ Národné centrum pre biotechnologické informácie. U.S. National Library of Medicine, n.d. Web. 21. februára 2017.
2. Shendure, Jay a Hanlee Ji. „Sekvenovanie DNA novej generácie.“ Správy o prírode. Nature Publishing Group, 9. októbra 2008. Web. 21. februára 2017

S láskavým dovolením:
1. „Kroky PCR“ od Tinojasontran - vlastná práca (public domain) cez Commons Wikimedia
2. „Polymerázová reťazová reakcia“ Enzoklop - vlastná práca (CC BY-SA 3.0) prostredníctvom Commons Wikimedia
3. „Sekvencia DNA“ Autorom Sjef - vlastná práca (Public Domain) prostredníctvom Commons Wikimedia