Rozdiel medzi primermi PCR a primermi na sekvenovanie
Share
Kľúčový rozdiel - PCR priméry vs sekvenovania primery
S nedávnym vývojom v oblasti molekulárnej biológie boli vyvinuté rôzne genetické techniky, vďaka ktorým boli procesy skúmania rôznych ciest subjektu ľahké a presné. PCR a ďalšie postupy sekvenovania sú dve dôležité také techniky. Používajú rôznych pomocných komponentov. Priméry sa považujú za hlavný podzložok spoločný pre techniky PCR aj Sequencing. Priméry PCR sa používajú na amplifikáciu konkrétnej sekvencie DNA, zatiaľ čo svyrovnávacie priméry sa používajú v súvislosti so sekvenovaním fragmentu DNA so zámerom odhaliť jeho špecifický poriadok nukleotidovej sekvencie.. To je kľúčový rozdiel medzi primermi PCR a primermi na sekvenovanie.
OBSAH
1. Prehľad a kľúčový rozdiel
2. Čo sú to PCR priméry
3. Čo sú priméry na sekvenovanie
4. Podobnosti medzi primermi PCR a primermi na sekvenovanie
5. Porovnanie bok po boku - PCR priméry vs sekvenčné priméry v tabuľkovej forme
6. Zhrnutie
Čo sú priméry PCR?
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je genetická technika, ktorá sa používa v oblasti molekulárnej biológie s cieľom amplifikovať jednu alebo niekoľko kópií konkrétneho segmentu DNA a získať mnoho miliónov identických kópií. Pri PCR reakcii sa používajú rôzne zložky vrátane primerov. Priméry sú krátke vlákna DNA s dĺžkou nukleotidov 18 až 25, vďaka čomu sú kompatibilné so začiatkom a koncovou oblasťou fragmentov DNA, ktoré sa majú amplifikovať. Priméry môžu byť forward primer a reverzný primer. Tieto priméry sa viažu na fragment DNA v špecifických bodoch, kde spôsobuje, že sa DNA polymeráza viaže na špecifický primér v mieste a iniciuje syntézu nového reťazca DNA..
Výber primérov je dôležitým aspektom procesu PCR. Dôležitý je výber dĺžky primeru. Ideálna dĺžka by mala byť 18 až 25 nukleotidov. Ak je dĺžka príliš krátka alebo príliš dlhá, priméry sa neviažu na sekvenciu DNA, ktorá sa má presne amplifikovať. Príliš krátke primery vedú k nešpecifickému primiešaniu primerov na rôznych miestach DNA sekvencie.
Obrázok 01: PCR priméry
Obsah guanínu a cytozínu (GC) v dobrom priméri by mal byť v rozmedzí 40 - 60. Teplota žíhania priméru a teplota topenia sú životne dôležité faktory počas PCR. Teplota topenia by sa mala vypočítať presne a teplota žíhania priméru by mala byť 5 0C nižšia ako teplota topenia. Teplota topenia by mala byť 60 ° C a 75 ° C. Príliš vysoké alebo príliš nízke teploty budú mať za následok nižšiu aktivitu DNA polymerázy.
Čo sú priméry na sekvenovanie?
Sekvenačné priméry sa používajú v kontexte sekvenovania DNA fragmentu s cieľom odhaliť jeho špecifickú identitu. Na získanie dobrých výsledkov sekvencovania sú dôležité vysoko kvalitné priméry a šablóny. Teda, keď sú vybrané priméry, mali by byť jedinečné pre konkrétnu oblasť, v ktorej chceme sekvenovať. Malo by byť tiež so správnou orientáciou, kde sú sekvencie obvykle generované z 3 'až 5' koncov primérov. Sekvencii by nemala chýbať nežiaduca samohybridizácia, ako je tvorba vlásenkových slučiek. Nemala by obsahovať následnú tvorbu guanínových báz.
Teplota topenia (Tm) primeru musí byť vhodná pre podmienky sekvenovania. Preto by mal byť medzi 52oC a 74oC. Príprava oligonukleotidov, ktoré sa majú použiť ako primér, by sa mala purifikovať, aby sa získala požadovaná úplná dĺžka sekvencie. Pokiaľ oligonukleotidy obsahujú nečistoty, signálna sekvencia primerov bude superponovaná z rôznych miest primingu a tiež zníži počet základných buniek..
Obrázok 02: Sekvenčné priméry
Teplota topenia primeru (Tm) oligonukleotidu určuje, ako silné sú komplementárne vlákna DNA navzájom hybridizované. Tm sa môže považovať za termodynamický výpočet, keď je závislý od DNA sekvencií a od niekoľkých podmienok, ako je napríklad koncentrácia soli. Tm je dôležitá počas PCR, kde sa na produkciu skupiny fragmentov zakončených dideoxynukleotidmi používa variant nazývaný sekvenovanie cyklov. Tu bude primer, ktorý je sekvenovaný, najprv nasedaný alternatívne, potom predĺžený a nakoniec denaturovaný pre amplifikáciu. Hodnota Tm by sa preto mala pohybovať medzi 52oC a 74o C. Syntetizované oligonukleotidy je možné získať z laboratórií na syntézu DNA / RNA podľa výberu. Malá syntéza, ktorá sa používa na sekvenovanie DNA, je zvyčajne 50 nmol. A čo je najdôležitejšie, priméry použité na sekvenovanie by mali byť purifikované, aby neobsahovali nečistoty, ktoré zabránia zníženiu kvality.
Aké sú podobnosti medzi primermi PCR a primermi na sekvenovanie?
- Priméry PCR aj priméry na sekvenovanie sú priméry, ktoré sa používajú v procese amplifikácie cieľovej sekvencie DNA.
- Oba priméry PCR a priméry na sekvenovanie sú zložené z nukleotidov.
- Ako priméry PCR, tak sekvenačné priméry sú krátke oligoméry.
Aký je rozdiel medzi primermi PCR a primermi na sekvenovanie?
Priméry PCR vs Sekvenčné priméry | |
| Priméry PCR sú krátke reťazce DNA s dĺžkou nukleotidovej sekvencie 18 až 25, vďaka čomu sú kompatibilné so začiatkom a koncovou oblasťou fragmentov DNA, ktoré sa majú amplifikovať.. | Sekvenčné priméry sú krátke oligoméry, ktoré sa používajú v kontexte sekvenovania fragmentu DNA s cieľom odhaliť jeho špecifickú identitu.. |
| funkcie | |
| Priméry PCR sa používajú na amplifikáciu konkrétnej sekvencie DNA. | Sekvenačné priméry sa používajú v kontexte sekvenovania DNA fragmentu s cieľom odhaliť jeho špecifickú identitu. |
| Počet potrebných primerov | |
| Dva primery; jeden priamy primer a jeden reverzný primer sa používajú ako priméry PCR. | Ako sekvenčný primer je potrebný iba jeden primer. |
zhrnutie - PCR priméry vs sekvenovania primery
Sekvenačné priméry sa používajú v kontexte sekvenovania DNA fragmentu s cieľom odhaliť jeho špecifickú identitu. Na uskutočnenie procesu bude stačiť jeden sekvenčný primer. Na dosiahnutie dobrých výsledkov sekvenovania sú dôležité kvalitné primery a šablóny. Teda, keď sú vybrané priméry, mali by byť jedinečné pre konkrétnu oblasť, v ktorej chceme sekvenovať. PCR priméry sú krátke vlákna DNA s nukleotidovou dĺžkou 18 až 25, ktoré sú kompatibilné so začiatkom a koncovou oblasťou fragmentov DNA, ktoré sa majú amplifikovať. PCR priméry môžu byť priamym primérom a reverzným primérom. Obsah guanínu a cytozínu (GC) v dobrom priméri by mal byť v rozmedzí 40 - 60. Teplota žíhania priméru a teplota topenia sú životne dôležité počas PCR. Toto je rozdiel medzi primermi PCR a primermi na sekvenovanie.
referencie:
1. „Polymerázová reťazová reakcia (PCR).“ Khan Academy. K dispozícii tu
2. „Sekvencovanie primerov a návrh primerov.“ Sekvenovanie primerov a návrh primerov Služby základnej DNA univerzity Univerzita v Calgary. K dispozícii tu
S láskavým dovolením:
1.'Primers RevComp'By Zephyris - Vlastná práca, (CC BY-SA 3.0) prostredníctvom Commons Wikimedia
2. 'Metódy označovania DNA Sequencin 3'By Abizar (pôvodný uploader) na anglickej Wikipédii - Prenesené Gustavocarrou., (Public Domain), prostredníctvom Commons Wikimedia
