Rozdiel medzi RT PCR a QPCR

Kľúčový rozdiel - RT PCR vs QPCR
 

Polymerázová reťazová reakcia je technika používaná na amplifikáciu špecifickej oblasti DNA in vitro. Vďaka vynálezu tejto techniky od Kary Mullis v roku 1983 sú vedci schopní na výskumné účely vyrobiť tisíce až milióny kópií špecifických fragmentov DNA. V súčasnosti sa stala bežnou a bežne vykonávanou technikou v klinických a výskumných laboratóriách pre široké spektrum aplikácií. Existujú variácie tradičnej techniky PCR, ako je RT PCR, vnorená PCR, multiplexná PCR, Q PCR, RT - QPCR atď. RT PCR a Q PCR sú dve dôležité variácie PCR. Kľúčový rozdiel medzi RT PCR a Q PCR je v tom RT PCR sa používa na detekciu génovej expresie vytvorenímkomplementárna DNA (cDNA) transkripty z RNA zatiaľ čo Q PCR sa používa na kvantitatívne meranie produktov PCR v reálnom čase pomocou fluorescenčných farbív.

OBSAH
1. Prehľad a kľúčový rozdiel
2. Čo je RT PCR
3. Čo je QPCR
4. Porovnanie vedľa seba - RT PCR vs QPCR
5. Zhrnutie

Čo je RT PCR?

Reverzná transkripčná polymerázová reťazová reakcia (RT PCR) je variantom PCR, ktorý sa používa na detekciu expresie RNA. Je to veľmi dôležitá metóda na detekciu expresie mRNA v tkanivách. RT PCR sa používa, keď východiskovým materiálom vzorky je RNA. V RT PCR je templátová mRNA najskôr konvertovaná na komplementárnu DNA. Tento krok je katalyzovaný enzýmom reverzná transkriptáza a tento proces je známy ako reverzná transkripcia. Po druhé, pre novo syntetizovanú cDNA na amplifikáciu sa používa tradičná PCR.

RT PCR je vysoko citlivá technika, ktorá vyžaduje relatívne malé množstvo vzorky RNA. RT PCR sa bežne používa pri diagnostike a kvantifikácii druhov RNA, najmä vírusov RNA, ako je vírus ľudskej imunodeficiencie a vírus hepatitídy C.

Obrázok 01: RT PCR technika

Čo je QPCR?

Kvantitatívna PCR (QPCR) je variant PCR, ktorý sa používa na kvantitatívne meranie produktov PCR. Nazýva sa tiež polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase, pretože meria amplifikáciu reálneho času pomocou PCR stroja v reálnom čase. Je to vhodný spôsob na stanovenie množstva cieľovej sekvencie alebo génu prítomného vo vzorke. Zaujímavou črtou QPCR je to, že kombinuje amplifikáciu aj skutočnú kvantifikáciu do jedného kroku. Potreba gélovej elektroforézy pri detekcii môže byť preto eliminovaná technikou QPCR. QPCR používa fluorescenčné farbivá na označenie produktov PCR počas PCR reakcií, ktoré nakoniec vedú k priamej kvantifikácii. Keď sa produkty PCR akumulujú, fluorescenčné signály sa tiež akumulujú a budú merané prístrojom v reálnom čase. QPCR sa môže kombinovať s RT PCR. Je známy ako RT - QPCR alebo QRT - PCR a považuje sa za najúčinnejšiu, najcitlivejšiu a kvantitatívnu metódu na detekciu hladín RNA v bunkách alebo tkanivách..

SYBR Green a Taqman sú dve metódy používané na detekciu alebo sledovanie procesu amplifikácie PCR v reálnom čase. Metóda SYBR Green sa uskutočňuje s použitím fluorescenčného farbiva zvaného SYBR green a detekuje amplifikáciu väzbou farbiva za vzniku dvojvláknovej DNA. Taqman sa uskutočňuje s použitím sond s dvojitou značkou a detekuje amplifikáciu degradáciou sondy Taq polymerázou a uvoľňovaním fluoroforu, ako je znázornené na obrázku 02. Obidve tieto metódy monitorujú priebeh procesu amplifikácie a vykazujú množstvo produktu v reálnom čase..

PCR v reálnom čase má širokú škálu aplikácií, ako je kvantifikácia génovej expresie, analýza mikroRNA a nekódujúcej RNA, genotypizácia SNP, detekcia variantov počtu kópií, detekcia zriedkavých mutácií, detekcia geneticky modifikovaných organizmov, detekcia infekčných agensov atď..

Obrázok 02: Kvantitatívna PCR technika

Aký je rozdiel medzi RT PCR a QPCR?

RT PCR vs QPCR
RT PCR je technika používaná na detekciu génovej expresie amplifikáciou.	QPCR je technika, ktorá amplifikuje DNA a kvantifikuje produkty PCR v reálnom čase.
Zapojenie enzýmu reverznej transkriptázy
Enzýmová reverzná transkriptáza sa používa pre RT PCR.	Enzýmová reverzná transkriptáza sa nepoužíva pre QPCR.
Použitie fluorescenčne označených molekúl
Fluorescenčné značené farbivá alebo sondy sa pre RT PCR nepoužívajú.	Na QPCR sa používajú fluorescenčné značené farbivá alebo sondy.
Kvantifikácia produktu PCR
Pokiaľ nie je spojený s QPCR, RT PCR nekvantifikuje produkt PCR.	QPCR kvantitatívne meria produkt PCR.
Východiskový materiál
Východiskovým materiálom je mRNA.	Východiskovým materiálom je DNA.
Syntéza cDNA
Doplnková DNA sa vytvára počas RT PCR.	Počas QPCR sa nevytvára komplementárna DNA.

Zhrnutie - RT PCR vs QPCR

RT PCR a QPCR sú dve verzie tradičnej PCR. Technika RT PCR sa vykonáva pre vzorky mRNA a je poháňaná reverznou transkripciou a produkciou cDNA. QPCR sa používa na kvantifikáciu produktov PCR počas tepelných cyklov PCR v reálnom čase pomocou fluorescenčných farbív alebo značených sond. V QPCR je množstvo produktu PCR reprezentované emitovanými fluorescenčnými signálmi vzorky. RT PCR sa bežne používa ako proces amplifikácie, zatiaľ čo QPCR sa bežne používa ako proces kvantifikácie. Toto je rozdiel medzi RT PCR a QPCR.

Referencie:
1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo a GK Agrawal. „Real-time PCR: Revolučná detekcia a expresná analýza génov.“ Súčasná genomika. Bentham Science Publishers Ltd., jún 2007. Web. 03. apríl 2017
2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh a Jo Vandesompele. „Priama a citlivá analýza génovej expresie vzoriek FFPE založená na RT-qPCR.“ Správy o prírode. Nature Publishing Group, 22. februára 2016. Web. 03. apríl 2017
3. Overbergh, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon a C. Mathieu. „Použitie PCR v reálnom čase s reverznou transkriptázou na kvantifikáciu expresie cytokínového génu.“ Journal of Biomolecular Techniques: JBT. Asociácia zariadení pre biomolekulárne zdroje, marec 2003. Web. 03. apríl 2017

S láskavým dovolením:
1. „Taqman“ Autor: Braindamaged - Vlastné dielo pôvodného používateľa, ktorý nahral video (Public Domain) cez Commons Wikimedia
2. „Reverzná transkripčná polymerázová reťazová reakcia“ Autor: Jpark623 - Vlastné dielo (CC BY-SA 3.0) cez Commons Wikimedia